硫杆菌属反硝化菌自养反硝化作用电极电子的直接摄取外文翻译资料

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硫杆菌属反硝化菌自养反硝化作用电极电子的直接摄取

摘要

本文介绍硫杆菌属反硝化菌可以直接利用电极，作为其唯一的电子给体自养生物电化学系统的反硝化作用。通过催化电极表面的生物膜来观察和分析电压依赖反硝化过程，-500毫伏的最大硝酸盐去除率为21.12plusmn;1.67毫克分子，NOminus;3minus;N Lminus;1 dayminus;1 mminus;2 。媒介物(亚硝酸盐和一氧化二氮)显示，反硝化作用是主要的电子传递途径,在这个过程中，异化的铵硝酸盐还原成氨盐基是不存在的。循环伏安法揭示了适应潜力在生物膜的电化学活动中发挥了重要作用。电子转移抑制剂表明，一酰胺酰胺肽，二酰胺酰胺肽和三酰胺酰胺肽参与了自养反硝化作用中电子的转移。

1.简介

微生物反硝化作用通常用于废水处理中去除硝酸盐，这个过程通常由氧化铵作用和硝酸厌氧还原构成[1]。与特定条件的生物过程相比，生物电化学系统(BES)能提供一种较有保障的方法，在去除电子粒的同时去除硝酸盐[2 - 4]。因此，越来越多的研究把兴趣和注意力集中在生物电化学反硝化作用上。吉欧罗吉（Georogy）等人证明，地杆菌属metallreducens可以用一个石墨电极作为唯一的电子供体来实现硝酸还原[5]。这样的生物电化学系统能够避免与外部有机碳发生反应，这种反应可能导致成本上升或造成二次污染[6]。在这方面，很多人尝试直接用电流来给微生物增加动力，以进行反硝化微生物反应[7]。据报道，混合培养物和一些纯培养物，如假单胞菌alcaliphila，在缺少有机物质的情况下，利用来自电极的电子进行无机营养反硝化作用，这意味着它因其低C / N率(11、12)而在废水处理中极具潜力。然而，具有唯一电子供体的纯培养物移除自养硝酸盐的相关信息仍然是有限的。

此前，加藤等人以及罗德里格斯等人曾对化能自养反硝化细菌，即硫杆菌属反硝化菌的阴极活动做出过评估。[13，14]。然而,这种电化学反应链仍受质疑，它是否可以作为生物电化学系统中反硝化催化剂。另一方面，虽然细胞外电子从细菌转移到电极的机制曾被广泛研究和了解， 反方向转移亦然，也就是说，从电极输入到细菌细胞的电子，在很大程度上仍有待阐明。

本文首先阐述了以电极为唯一给电子体的生物电化学系统中，硫杆菌属反硝化菌在反硝化作用中的表现。文章选择了不同的电极电位来探讨电极电位对反硝化率的影响。循环伏安法(CV)和扫描电镜(SEM)分别被用于确定电极上生物膜的电化学活性和形态。

2.实验

2.1 微生物和培养

硫杆菌属反硝化菌是(DSM 12475)从德国微生物采集处und Zellkulturen购买的。为了准备培养液，T反硝化菌是在30摄氏度的DSM的113培养基中培养的。

2.2生物电化学系统的安装和操作

每个装有110毫升液体，顶部空间剩余50毫升体积的生物电化学反应器如前所述[15]。碳毡(3厘米times;5厘米)，碳布(7厘米times;7厘米)，饱和甘汞电极(SCE)分别被用作阳极、阴极和参考电极。反应器被连接到一个多能稳电压上(CHI1040中国上海晨华有限公司)，电压分别为-500，minus;300，minus;100和 250 毫伏的阴极电位。这些电位均高于minus;600 毫伏，避免系统产生氢气[16]。每个反应器在30摄氏度下运行一式三份，开路电位((OCP)反应器则被用作控制器。除了没有细菌接种到阴极之外，非生物电化学反硝化作用也以类似的方式进行。本研究报告中的所有电位相当于标准氢电极（SHE），除非另有注明。阴极电解液是在DSM 113培养基中放入了2毫米硝酸盐，省去硫代硫酸钠和氯铵根。阳极室被110毫升的0.1毫磷酸钾缓冲溶液 (PBS，PH值7.0) 所填满。实验前，所有的反应器和电解质经过了高压蒸汽处理，并用二氧化碳进行吹扫，然后用橡胶瓶塞密封。对数生长期的纯培养T反硝化菌被收集及清洗数次，然后转移到阴极(OD600 = 0.1)。除了使用二氧化碳之外[17]，如前所述，电极上的生物膜可适应30天。在后适应期加入生物电化学系统（-500毫伏）的电子传递抑制剂双香豆素，奎纳克林双环乙基碳化二亚胺 (DCCD)，鱼藤酮和抗霉素A都是标准的[18]。等量溶剂（(水、乙醇或丙酮)）对照实验对当前阶段没有显著的影响。

2.3 分析技术

如前所述，阴极室里的硝酸(NOminus;3minus;N) 和亚硝酸盐(NOminus;2— N)由离子色谱 (ICS - 90 DIONEX 美国) 所决定[19]。用装有电子捕获检测器 (ECD) (GC7900 天美科学仪器有限公司，中国) 气相色谱仪来分析顶部空间的一氧化二氮。电化学原位红外光谱观测活细菌也以如前所述的同样方式进行[20]。生物膜蛋白质的测量和扫描电镜样品准备工作(S- 4800FESEM，日立公司，日本)也以如前所述的方式进行[21，22]。

3. 结果与讨论

3.1 生物电化学反应器中T反硝化菌的电子吸收

T反硝化菌在装有硝酸盐，拥有-500，minus;300，minus;100或 250 毫伏等不同电位的生物电化学系统中适应了一个月之后，可观察到预期的阴极电流 (图1)。每个电极的电流在培养了四天之后随着时间的流逝而增强，然后达到最大值，大约分别为160.83，76.51，29.46和11.39微安。相比之下，非生物控制反应器中产生了可忽略的电流，为-500毫伏。这些结果表明，T反硝化菌生物膜可以利用来自电极的电子进行自养代谢。

如图2所示，几乎没有细菌细胞在开路电路控制电极上繁殖。相比之下，一层薄薄的杆状细胞稀疏地分布在四个电位的电极表面。-500，minus;300，minus;100， 250 毫伏电极的生物膜蛋白质总量分别为每平方厘米3.67plusmn;0.50，2.48plusmn;0.18，2.84plusmn;0.39，2.60plusmn;0.19微克。这些低生物量可能是由于自养生物膜的生长速度缓慢[23]。

图1以电极作为唯一电子给体的T反硝化菌生物膜所产生的电流

3.2 生物电化学系统中的反硝化作用

伴随电流一起产生的硝酸酯逐渐被消耗并还原所积累的产物。如图3a所示，较低的阴极电位的硝酸盐去除率更高。15天的潜伏期后， minus;500, minus;300, minus;100, and 250 毫伏的反应器中，硝酸盐的量分别减少75.62plusmn;5.97%，58.52plusmn;6.05%，48.38plusmn;5.71% 和26.80plusmn;5.23% 。随着电极电位降低，计算得出的整体硝酸盐还原率从7.50plusmn;1.46增加到1.46plusmn;21.12毫克分子NOminus;3minus;N Lminus;1 dayminus;1 mminus;2， 这正好与阴极电流的顺序一致。T反硝化菌的这些活动低于G. Metallireducens (90毫克分子NOminus;3minus;N Lminus;1 dayminus;1 mminus;2)和假单胞属alcaliphila (160 毫克分子 NOminus;3minus;N Lminus;1 dayminus;1 mminus;2) [5,12]。相比之下，开路电位控制的硝酸盐还原率仅为0.58plusmn;0.39毫克分子NOminus;3minus;N Lminus;1 dayminus;1 mminus;2。此外，在-500毫伏的非生物反应器中硝酸盐并未减少，也没有产物(亚硝酸盐，一氧化二氮和铵)累积。这表明，碳布电极不能有效地催化电化学硝酸盐单独减少。所有运用的电极的反应器均为检测氮，否定了氮作为媒介进行电子转移反应的可能性。结果，实验数据表明，T反硝化菌生物膜可以直接利用来自电极的电子，作为电极表面的生物催化剂去除硝酸盐。

由将电极作为唯一的电子给体的T反硝化菌生物膜自养反硝化作用产物资料如图3 b和c所示。虽然在整个实验过程中没有对氮进行检测，但亚硝酸盐和一氧化二氮(N2O) 仍被确定为媒介产品。15天后，minus;500, minus;300, minus;100, and 250 毫伏的反应器分别产生了1.39plusmn;0.18毫米，0.18plusmn;0.12毫米，0.91plusmn;0.11毫米和0.19plusmn;0.14毫米亚硝酸盐。一氧化二氮在前几日迅速积累，然后一氧化二氮浓度逐渐降低。这表明，媒介一氧化二氮进一步转化为氮气或其他氮化物。系统没有检测铵离子，表明减少的异化硝酸盐转化为了铵(DNRA)。库仑效率的分析显示，55%到72%的阴极电子在反硝化产物中得以恢复(图3 d)。阴极电子的部分损失大概是由电极生物膜的增长和维护造成的。

图2 由minus;500 毫伏(a)，minus;300 毫伏(b)，minus;100 毫伏(c)， 250 毫伏(d)的开路电位(控制、e)的生物膜在电极表面的SEM图像，以及电极的生物膜蛋白质(f)。

3.3 T反硝化菌生物膜的电化学活性

用CV扫描来探究T反硝化菌生物膜的电化学活性，共15天来进行此项实验。如图4所示，比起开路电路所控制的电极，所有的生物膜电极都展现了更高的催化电流。CV扫描中，生物膜减少的峰值出现在minus;310毫伏，而开路电路控制的电极则没有观测到明显的峰值。因此，至少有一个氧化还原成分可能负责对电子转移反应。为了鉴别氧化还原剂是否位于生物膜或培养基中，对-100毫伏的生物膜电极进行不同速率的扫描。-310毫伏峰值电流的还原反应随着扫描速率从1-20毫伏/秒增加而直线上升(图4 b)。这意味着氧化还原物主要可归因于生物膜电极上而不是溶液中的溶解物[24]。此外，当生物阴极被非生物碳布电极取代时，CV扫描没有检测到培养基中的峰值(数据未显示)。因此表明，T反硝化菌不排出穿梭于整个实验的细胞外电子，生物膜以直接的方式利用电极电子。

图3 减少生物电化学中的硝酸盐(a)和反硝化产物积累，比较不同电位的总电子转移和库仑效率(d)。

图4 所选电极电位中生物阴极的变化CV图 (扫描速率，10 毫伏/秒)（a）；minus;100 毫安电极电位在不同扫描速率下的变化图(b)；活T反硝化菌在不同电位的电化学原位红外光谱(c)；电子传递抑制剂对电子吸收的影响(minus;500 毫伏)（d）和提出的电化学反硝化作用电子转移途径（e）。

3.4 电子转移机制

电化学原位红外光谱和电子传递抑制剂被用来研究氧化还原剂和T反硝化生物膜的电子转移机制。主要信号频段控制(在1667和1551/厘米)的红外光谱分别来自于一酰胺酰胺肽链和二酰胺酰胺肽链,分别(图4 c)[25]。小强度增加1551和1716/厘米的频段控制观察时，电极电位逐渐从100 毫伏下降到800 毫伏。后者频段可以分配给羰基(C_O)组[20]。这些结果表明，在这个过程中，细胞电极界面发生了一定的氧化还原反应。此外，出现在1407/厘米的峰值表明了表面血红素组Cyt-C的存在[25,26]。

双香豆素，一种醌循环的抑制剂，展现了在生物电化学活动中明显的抑制作用(图4 d)。奎纳克林,封锁住了二酰胺酰胺肽中的黄素腺嘌呤二核苷酸和黄素单核苷酸，在低浓度(0.20毫米)时对电流不产生任何作用。然而,增加奎纳克林的剂量(3.20毫米)导致阴极电流减少，表明二酰胺酰胺肽参与电子传递。腺苷三磷酸酶抑制剂数字电荷耦合掐(1.55毫米)和一酰胺酰胺肽(NADH还原酶)抑制剂鱼藤酮(1.88毫米)几乎完全抑制当前电流。类似的抑制效果在增加三酰胺酰胺肽抑制剂抗霉素A时也会观察到。因此，可获电子转移路径(图4 e)[27,28]。

4. 结论

实验结果表明，T反硝化菌生物膜可以直接利用固体电极作为唯一的电子供体来去除自养硝酸盐。反硝化作用被确定为主要的电子转移途径,而异化的硝酸盐还原铵(DNRA)在这个过程中不存在。生物电极的生物电化学反硝化作用取决于应用的电极电位。电子转移抑制剂表明，一酰胺酰胺肽，二酰胺酰胺肽和三酰胺酰胺肽参与了自养反硝化作用中电子的转移。

利益冲突：

该实验不存在利益冲突。

致谢

该项目得到了广东省自然科学基金杰出青年学者(2014 a030306033和S20120011151)、广东省自然科学基金(S2013040015231)和广州市科学技术项目(201510010025)的大力支持。特此感谢孙世强（音）教授和厦门大学L.X博士援助红外光谱实验。

参考文献

C. Fang, B. Min, I. Angelidaki, Nitrate as an oxidant in the cathode chamber of a microbial fuel cell for both power generation and nutrient removal purposes, Appl. Biochem. Biotechnol. 164 (2011) 464–474.

Y.H. Jia, H.T. Tran, D.H. Kim, S.J. Oh, D.H. Park, R.H. Zhang, D.H. Ahn, Simultaneous 资料编号：[140665]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word