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水凝胶束缚增强单链抗体的域间稳定性

摘要：在这里，我们确定了分子拥挤剂在scFv抗体功能稳定中的重要性。通过工程化的钙调蛋白（CaM）结合肽将抗体栓连到由聚（乙二醇）（PEG）官能化的CaM组成的刺激响应性水凝胶中。通过瞬态加热调节大分子拥挤，这降低了有效孔径。使用与scFv结合的荧光配体，使用频域荧光光谱法评估V_H和V_L结构域之间的结构偶联以及与功能稳定化的关系。在溶液中VH和VL结构域之间存在最小的结构偶联，这从结合配体的显着旋转迁移率显而易见，这提示VH和VL结构域的独立迁移率。相比之下，水凝胶基质用于在结构上偶联V_H和V_L结构域，导致在8.0M尿素存在下旋转迁移率降低和配体结合保留。在这些相同条件下，溶液中scFv抗体的配体结合被破坏。水凝胶中scFv抗体稳定性的增加不仅仅是分子拥挤的结果，因为孔径的减小会使配体结合不稳定。相反，我们的结果表明，PEG水凝胶基质内的scFv抗体的功能稳定化包括涉及蛋白质溶剂化的重要因子，其稳定V_H和配体结合所必需的VL结构域之间的域间相互作用。

介绍

基于抗体的固定化策略代表了抗原捕获的主要平台，并且能够开发用于鉴定环境因子和疾病生物标记物的低成本和可现场部署的诊断测定法。此外，已经有47种针对细胞因子，毒素或受体的治疗性单克隆抗体。经食品药品监督管理局批准，占新开发的治疗药物的20％以上。在这些发育管道中，高效细胞单链抗体的结合裂缝通常被整合到较大且更稳定的全长抗体（例如，Fab或IgG构建体）中。这些发育策略利用了内部特定功能。抗体序列，允许使用较小的单链抗体鉴定可变区，包括单链片段可变（scFv）融合构建体。小链的单链抗体可以创建多种文库，促进高通量选择和细胞成熟，从而能够选择性识别独特的靶抗原。然而，观察到全长抗体的可变区和恒定区之间的结构连接在转移结合特异性城市和不同抗体之间的效率方面产生固有的差异，导致发育时间和费用的显着增加。此外，扩增变异性，功能稳定性和常规抗体的大尺寸限制了治疗效果。

scFv抗体融合构建体涉及在源自免疫球蛋白的重（V_H）和轻（V_L）结构域之间设计短的（~27个氨基酸）柔性接头（图1A，C）。由于缺乏构象稳定性和溶解性差，常常无法在现场可部署的测定中使用单链抗体，这可能导致溶液中蛋白质聚集体的形成。寻求克服这些限制的当前方法受限于在抗原结合结构域内设计蛋白质稳定性和足够的灵活性以维持高效配体结合的竞争要求。部署单链抗体的能力具有显着的实际优势，因为可以使用成本高效且可重复的表达系统获得大量抗体。相比之下，限制抗体的广泛开发是与生产技术相关的缺点，这可能导致涉及可变结合选择性和功效的质量问题。因此，由于开发成本高（约50000美元），目前用于研究环境的高质量单克隆抗体数量有限。

图1：荧光配体在针对TNT的单链片段可变（scFv）抗体中的可变重链结构域（V_H）和可变轻链结构域（V_L）之间结合。 scFv融合蛋白的同源模型（图A）显示荧光配体TNB-Alexa488在V_H（N-结构域）和V_L（C-结构域）结构域之间的近似位置，TNT的荧光配体衍生物[即TNB-Alexa488和TNB-Alexa555] （图B），scFv序列突出显示连接VH和VL结构域的27-氨基酸接头序列（下划线;图C），以及与工程化麦芽糖结合蛋白（MBP）缀合的scFv抗体与工程化M13 CaM结合的示意图。 序列能够在由聚（乙二醇）官能化的CaM（图D）组成的水凝胶内进行束缚。

为了克服scFv抗体应用的当前局限性，我们试图了解我们之前的观察结果，scFv抗体在掺入硅藻生物硅中时功能稳定。这些生物硅基质表明分子拥挤可能在防止蛋白质解折叠和功能失活方面发挥作用，使用聚（乙二醇）二丙烯酸酯（PEGDA）水凝胶基质研究，该基质通过位于每个相对的球状结构域上的两个工程化半胱氨酸共价结合钙结合蛋白钙调蛋白（CaM）。在这些材料中，系链蛋白被改造成含有CaM结合肽（即来自肌球蛋白轻链激酶的M₁₃），其在钙存在下与水凝胶基质内的CaM结合（图1D）。这些水凝胶基质中的蛋白质动力学可以通过瞬时加热来控制，其起到降低有效孔径和增加测试蛋白质（即麦芽糖结合蛋白，MBP）的侧链旋转动力学的作用。控制有效孔径和相关蛋白质动力学的能力有助于探索拥挤剂如何稳定一系列蛋白质，包括scFv抗体。我们希望这些见解能够促进新开发抗体的快速部署和应用范围。

结论

一.高效率配体与scFv抗体结合

我们研究了水凝胶材料如何稳定与MBP-M13（MBP *）交联的scFv抗体，其分子动力学已知对水凝胶基质中的孔径敏感。为此，我们交叉了高效率。 通过加入10倍摩尔过量的胺反应性交联剂双（磺基琥珀酰亚胺基）辛二酸酯，对三硝基甲苯（TNT; Kd = 0.5nM）至MBP *的scFv。预期该交联剂的长度为11.4Aring;可增强scFv抗体的独立旋转迁移率。 加入双（磺基琥珀酰亚胺基）辛二酸酯交联剂后，scFv和MBP *特征性条带消失，交联蛋白复合物出现十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳表观质量分布。（SDS-PAGE;图2）。 scFv和MBP *之间的分子间交联导致质量的大量增加，并且SDS-PAGE上的迁移率相关性降低。相反，scFv或MBP *内的分子内交联导致它们各自在SDS-PAGE凝胶上的迁移率增加，正如基于它们不能完全展开所预期的那样。

图2：在将scFv交联至MBP后保留高亲和力结合。 TNB-Alexa555（5.0nM）之前（菱形;黑线）和加入scFv（1.0mu;M;圆形，蓝线）或scFv-MBP交联蛋白（1.0mu;M;三角形，红线）之后的代表性荧光相关曲线。 插图：scFv（1.5mu;g;泳道1），MBP *（2.0mu;g;泳道2）的SDS-PAGE，scFv（1.5mu;g）和MBP *（2.0mu;g）的混合物（泳道3）之前和之后（泳道） 4）用10倍摩尔过量的胺反应性交联剂双（磺基琥珀酰亚胺基）辛二酸盐孵育1小时，并用50mM Tris（pH7.5）猝灭1小时。

我们还使用荧光相关光谱法（FCS）评估了交联后蛋白质功能的保留以测量配体结合。 在不存在和存在添加的scFv或scFv-MBP *的情况下，这些测量评估三硝基甲苯的荧光类似物即TNB-Alexa555（图1B）的翻译差异。 因为我们的实验是使用低TNB-Alexa555浓度（即5.0nM）进行的，所以TNB-Alexa555的翻译差异的任何降低都是高效率结合的诊断。 与单独的TNB-Alexa555相比，添加scFv或交联的scFv-MBP *复合物导致相关函数向更长时间的显着变化（图2）。这些结果表明，无论与MBP *的交联如何，都保留了高效的TNB-Alexa555结合。

拟合自相关函数，我们能够确定平移差异系数（D_t）。对于溶液中的TNB-Alexa555，Dt为2.2plusmn;0.4times;10 -6 cm 2 / s。相比之下，结合scFv后D_t降低至0.62plusmn;0.04times;10-6 cm2 / s，这与使用同源scFv结构的流体动力学计算的预期D_t（即0.85times;10-6 cm2 / s）一致。 （即3GM0）作为同源模型的基础（图1A）。相比之下，将MBF *与TNB-Alexa555交联的scFv温育后，Dt进一步降低32plusmn;5％（即0.42plusmn;0.02times;10-6 cm2 / s），与TNB-一致。 Alexa555相对于单独的scFv（质量= 30kDa）与更大的scFv-MBP *复合物（质量= 84kDa）结合。在所有情况下，假设单个平移差分系数，获得最优非线性最小二乘法。在加入第二种不同的系数时，没有观察到改善，这是未结合的TNB-Alexa555的特征。这些结果表明基本上所有的分析物（配体）（即5.0nM TNB-Alexa555）都与scFv抗体结合。

在其功能表征之前，使用尺寸排阻色谱法分离scFv和MBP *之间的复合物。在这些实验中，我们首先用5倍摩尔过量的荧光配体TNB-Alexa488或TNB-Alexa555孵育样品。相对于未交联的MBP *或scFv，scFv-MBP *复合物的峰分离是明显的（图3），其中scFv-MBP *复合物在出现之前与TNB-Alexa488或TNB-Alexa555共洗脱。 MBP *或scFv。与分离相关的峰面积的光密度分析表明（i）总scFv抗体的60％与MBP交联，并且（ii）68％的总TNB-Alexa Fluor染料与交联的scFv结合-MBP。剩余的32％的TNB-Alexa Fluor染料与未交联的scFv（总scFv蛋白的40％）结合。 TNB-Alexa Fluor染料与未交联的scFv抗体结合的化学计量的适度降低可能是分子内交联的结果，其可能干扰分析物结合。交联的scFv-MBP结合等效化学计量的TNB-Alexa Fluor配体作为真正的scFv抗体的能力表明scFv和MBP *之间的交联不显着影响与scFv结合的分析物。

图3：与scFv-MBP结合的TNB-Alexa555或TNB-Alexa488的色谱分离。 在scFv和MBP *（1mg / mL）的化学交联之后，将5倍摩尔过量的TNB-Alexa555或TNB-Alexa488（70mu;M）在色谱分离之前温育1小时（25℃）。 在20mM HEPES（pH 7.5）中监测TNB-Alexa555（lambda;ex= 530nm;lambda;em= 565nm）或TNB-Alexa488（lambda;ex= 485nm;lambda;em= 532nm）的吸光度（280nm;蓝色曲线）或荧光发射。 ）和150 mM NaCl。

二．水凝胶基质中的分子拥挤和scFv抗体功能的稳定化

为了评估水凝胶基质在水凝胶中拴系的scFv抗体的功能稳定能力，我们测量了在8.0M尿素存在下孵育后的配体结合。在这些实验中，首先将TNB-Alexa555（5nM）与含有栓系的scFv抗体的水凝胶样品一起温育0.5小时，并且在重复洗涤后，基于剩余的荧光强度确定结合的TNB-Alexa555的量。在8.0M尿素存在下孵育1小时后，与对照样品（未添加尿素）相比，TNB-Alexa555结合显着保留（图4D）。 相比之下，添加8.0 M尿素后溶液中scFv的配体结合完全丧失，TNB-Alexa555（5 nM）的自相关函数基本相同，无论是否添加过量的scFv （1mu;M）（图4C）。

为了评估分子拥挤对功能稳定性的影响，通过在37℃下瞬时加热降低了有效孔径，这导致水凝胶基质的松弛（图4B）。减小孔径起到减少结合TNB-Alexa555的量的作用。（图4D）。这些观察结果表明，水凝胶基质中scFv的稳定性主要不是通过分子拥挤而产生的; 相反，其他机制有助于PEG拥挤剂在离液剂（即8M尿素）存在下稳定高效配体结合的能力。

通过它们在这些水凝胶基质内的束缚来理解scFv抗体的功能稳定化的基础是非常有意义的。 在这方面，通常认为亲水性聚合物如PEG通过排除的体积效应改变蛋白质功能，由此聚合物基质是惰性的并且降低可用体积以有利于更紧凑的蛋白质构象。然而，PEG不是惰性基质并且能够与嵌入的蛋白质形成瞬时的弱相互作用，这可能与蛋白质构象灵活性相反以稳定活性构象。这些软相互作用具有增加差异约束的效果，其类似于在细胞环境中观察到的分子相互作用，其作用是增加有效粘度。 此外，PEG可以修饰蛋白质溶剂化，这有可能影响蛋白质动力学和配体结合效率。

图4：PEG水凝胶中功能稳定的scFv抗体。 （A）scFv抗体（蓝色和绿色），其结合配体（红色）与MBP *（灰色条带）交联，通过MBP *（48 kDa）上的M13融合肽与CaM（蓝色）结合在PEG水凝胶基质（灰色珠子）内）在钙（红色球体）存在下。 CaM在引发PEG基质光交联之前，通过在位置34和110处引入的半胱氨酸之间的共价键形成水凝胶基质的一部分，所述半胱氨酸与聚（乙二醇）二丙烯酸酯（PEGDA）缀合。 （B）瞬时加热（37℃，14小时）后水凝胶基质的刺激响应松弛的表示，导致平均孔径减小.23（C）尿素（8.0M）破坏TNB-Alexa555与溶液中scFv的结合[50mM HEPES，（pH7.5），150mM NaCl，10mM CaCl₂,10％（v / v）甘油和0.02％（v / v）吐温20]，使用荧光相关光谱法测定TNB-Alexa555（5 nM）在不存在（实心黑色曲线）和存在（红色虚线曲线）的scFv（1.0mu;M）。 （D）在8.0M尿素（在25℃下1小时）中孵育之前（束缚）和随后（束缚 Delta;H）瞬时加热（14小时，37℃）后TNB-Alexa555与scFv-MBP *在水凝胶中的分数结合。 ）在20mM Tris（pH 7.5），150mM NaCl和2mM CaCl₂中。在使用CoolSnap HQ2相机（Photometrics Inc.，Tucson，AZ）收集图像后，使用ImageJ（https://imagej.nih.gov/ij/）测定结合的TNB-Alexa555。

三．水凝胶基质及TNB-Alexa488寿命大幅增加和蛋白质旋转迁移限制的原因。

为了进一步了解PEG如何在通常与蛋白质失活相关的条件下维持scFv功能的重要性，我们测量了在溶液和水凝胶基质中与scFv抗体结合的TNB-Alexa488的激发态寿命和旋转动力学。TNB-Alexa488用于这些实验，因为与TNB-Alexa555相比，它具有已知的环境敏感性和更长的激发态寿命。这允许测量水凝胶基质内的束缚

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