卷心菜，西红柿，红菠菜和莴苣苗期的石墨烯植物毒性外文翻译资料

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卷心菜，西红柿，红菠菜和莴苣苗期的石墨烯植物毒性

Parvin Begum, Refi Ikhtiari, Bunshi Fugetsu *

环境医学化学实验室，北海道大学环境科学研究所，札幌060-0810，日本

摘要：石墨烯对根和芽生长、生物量、形状、细胞死亡和活性的影响。研究了卷心菜、番茄、红菠菜和莴苣的活性氧簇(ROS)种类。浓度范围从500到2000毫克/升，结合形态学的结果。生理分析表明，在实验后20天的暴露时间，与对照相比，石墨烯显著抑制植物生长和生物量，在对照中，石墨烯处理的植物叶片的数量和大小都减少了剂量依赖性的方式。还发现了显著的影响，显示浓度依赖增加ROS和细胞死亡，以及坏死病变的可见症状，说明石墨烯对卷心菜、番茄和红菠菜的不良影响由氧化应激性坏死介导。生菜幼苗在相同的条件下，没有明显的毒性作用。石墨烯的潜在影响很大，取决于剂量、暴露时间和植物种类，值得进一步关注。

1．引言

近年来，在农业和技术应用领域，纳米结构的使用一直是一个活跃而令人兴奋的领域。石墨烯是最近发现的碳素异形体，它是一种二维的原子厚度结构，它可以被堆叠成三维石墨，可以被压成纳米碳管，或者被包裹成零维的富勒烯。石墨烯的独特的电子和传输特性，与现有的制造工艺兼容，而电子能谱的能量缺口的缺失，为未来电子器件的发展提供了越来越丰富的可能性和石墨烯基量子电子，提供了许多好处。如果纳米技术的这些趋势继续下去，石墨烯最终可能会被释放到水生、陆地和大气环境中，在那里它的命运和行为在很大程度上是未知的。由于这些植物强烈地与大气环境相互作用，所以在高等植物中暴露于纳米颗粒中是有影响的。纳米粒子具有超小型、特殊的形状、几何结构和独特的性质，可能有增加毒性的潜力。纳米粒子可以极大地改变其物理化学性质。碳纳米粒子可以穿透植物细胞，并诱导高剂量的植物毒性，导致一些作者得出结论，某些碳纳米颗粒不是100%安全的。因此，在考虑将基于纳米颗粒的产品引入市场时，提出了非常谨慎的建议，并且迫切需要与纳米毒理学领域相关的研究。例如，最近的一项研究指出石墨烯可能对人体健康和细菌产生不利影响。

为了回应这些担忧，我们探讨了石墨烯是否能在高剂量的陆生植物中诱导高剂量的植物毒性，并暴露于不同浓度(0-2000毫克/升)的石墨烯。根据美国环保部门的指南，本研究使用的石墨烯浓度最高为2000毫克/升。此外，Rico等已经描述了纳米颗粒对食品作物产生明显的毒性作用，通常出现在纳米颗粒1000-4000毫克/L的浓度范围内。对粮食作物的毒性研究通常在高浓度(2000-5000毫克/L)的纳米颗粒中进行。Khodakovskaya等人研究了在番茄生长过程中石墨烯的毒性不显著，尽管他们只使用一种低浓度(50毫克/升)试剂的石墨烯，其层数很少，厚度2-5nm。在Sayes等的一项研究中，碳纳米颗粒功能化导致毒性效应显著下降。纳米颗粒对不同植物种类的影响可以随着植物生长阶段、方法和暴露时间的不同而变化，也取决于纳米颗粒的大小、浓度、化学成分、表面结构、溶解度、形状和聚集。

因此，据我们所知，石墨烯在陆生植物中可能产生的不利影响几乎是完全未知的。在这里，我们使用卷心菜、番茄、红菠菜和莴苣作为选择的作物，以研究石墨烯的毒性作用，并确定合适的目标植物种类，以便进一步研究与石墨烯有关的研究。潜在的目标包括各种各样的陆生植物，它们通常被特定的屏障所保护，如细胞壁。通过延长不同植物种类对碳纳米颗粒的长期暴露和高浓度的应用，可以使目标更有效，这可能导致根表面的聚集，细胞内的穿透，以及对毒性作用的贡献。本报告首次描述了石墨烯在幼苗生长、细胞死亡、活性氧(ROS)生成、形态变化等方面的植物毒性效应。我们的结果显示，石墨烯对卷心菜和番茄的毒性最大，其次是红菠菜，对生菜没有明显的毒性作用。

2．实验

2.1药剂和种子

这个实验中使用的药剂是从关东化工股份有限公司，Wako纯化工行业，Ltd.，或Sigma-Aldrich Inc.，日本。三种植物的种子。(甘蓝，芸苔属植物)番茄,;和莴苣在这里使用。研究购自日本札幌的Homac。红菠菜和苋菜种子是从孟加拉国的达卡购买的。

2.2水溶性石墨烯的制备

从天然石墨中提取水溶性石墨烯。(SP-1,Bay Carbon)使用改进的悍马和Offeman的方法。在典型的处理中，100克的石墨粉剂和50克硝酸钠和2000毫升硫酸在冰浴中混合了酸。接下来是100克高锰酸钾慢慢加入，混合均匀。混合后,该悬架被放置在一个水浴，在35 plusmn;3 ℃下混合了大约30分钟，大约5 L的去离子水加入悬浮，温度被升高到90 plusmn;3 ℃，悬架进一步混合30分钟，悬架最终被热去离子水和大约200毫升的30wt%双氧水稀释到10 L左右。温暖的悬浮液经过过滤，呈黄褐色。

2.3幼苗培育

所选植物的无菌种子被浸湿。在不同浓度的溶液中(0,500,1000，2000毫克/升)的石墨烯在夜间25摄氏度的黑暗中。种子放置在湿滤纸上，然后暴露于3毫升无石墨烯的测试溶液，并培养。在25摄氏度，直到发芽。发芽后,计算了发芽的种子数量。幼苗被转移到含有200毫霍格兰塑料罐中。霍格兰培养基pH值。在20天内几乎没有变化。石墨烯的曝光。PH被限制在6.3-6.5，适宜植物生长。幼苗用不同浓度的石墨烯处理(0,500,1000，2000毫克/升)。在2000 mg / L石墨烯稳定，几乎没有沉淀。

2.4 根与芽生长和叶性状。

经过20天的暴露，根和芽被分离。用清水冲洗，去除生长介质，用湿纸巾擦干表面水。记录他们的长度并记录了新鲜的重量和叶的数量统计。用RHIZO 2004b仪器测量叶面积。

2.5 ROS测量和H₂O₂检测。

通过光谱学对ROS的可视化和测量氧化敏感。经过处理的和未经处理的植物的新鲜叶片被感应出来。在DCFH-DA中，为ROS测量和过氧化氢的检测。经过3个PBS(磷酸盐缓冲盐水)冲洗，可视化的图像被使用。荧光显微镜(奥林巴斯IX70)。我们进行了叶片中DCFH荧光强度的测定。使用荧光光谱仪(日立F-4500)悬浮。在PBS缓冲液中带有激发波长的叶片。485 nm和发射波长522 nm。的值表示为荧光强度控制。这个实验是在没有暴露的情况下进行的光。采用DAB法检测H₂O₂。由Thordal-Christensen等人描述。新鲜的叶子从20天的处理和未经处理的植物被放置。1 克/升 - hcl, pH 3.2-3.8，在真空下培养。8小时，洗完叶后发现DAB沉积。煮沸100% (v/v)乙醇15分钟，使叶子脱色。除了深棕色聚合产物DAB与H₂O₂的反应这些图像被观察和记录。使用光学显微镜(透射光显微镜)。BX51，与奥林巴斯DP72相机)。甲瓒的数量用分光光度法测定叶片的形成。叶片在液氮中沉淀，在a中溶解2 M KOH和DMSO的混合物，比例为1:1.167 (v/v)。

2.6 评价细胞死亡

选择植物根系的细胞死亡进行评价。之前由Baker和Mock所描述的方法。伊文思蓝(0.025% v/v)在20天暴露后2小时。石墨烯的浓度(0、500、1000和2000毫克/升)。进行定量评估，经水多次冲洗。伊文思蓝提取了1% (w/v) SDS。50% (v/v)甲醇50摄氏度，15分钟，吸光度。(光密度)测定分光光度法。597 nm (V-530 UV/UISNIR分光光度计，日本Jasco)。细胞死亡被表达为被处理的根吸收。与未处理的根的对照。通过对离子泄漏的测量，对细胞死亡进行了评价。膜的损伤百分比是从电解质渗漏的处理和未处理，植物通过电导率法的方法和Lutts等的一些修改。叶样品(100毫克)放置在含有10毫升的试管中。三次洗涤后用蒸馏水除去表面污染，覆盖了试管。在振动器(100 rpm)室温下培养(25摄氏度)测定了溶液的电导率(Lt)。样品在120摄氏度的温度下蒸20分钟，。最终的电导率读数(L0)是在平衡时得到的。在25 摄氏度电解液泄漏被定义为:电解质渗漏(%)= (Lt/L0)·100膜的程度测定细胞损伤(电解质渗漏)。这里使用便携式电导仪。

2.7 原子力显微镜形态学观察。

原子力显微镜（AFM），扫描电子显微镜(SEM)和传输电子显微镜(TEM)

对于AFM，使用了Agilent系列5500 AFM仪器。这些样品是用稀释的水溶液制成的。石墨烯悬浮于云母表面。这些图片在扫描速度1赫兹下使用攻丝模式获得。对SEM来说，几滴石墨烯悬浮体是沉积在铝制短板上干燥静置。使用日立S-4000 SEM(日立，Ibaraki，日本)加速度为10kv。对SEM来说，根是。固定在2.5%戊二醛(GA)和2%聚甲醛。(PA) 0.1 M磷酸盐缓冲液(PB)， pH 7.4，后固定1%。四氧化锇，脱水，临界干燥和观察。对于TEM，石墨烯是均匀的。分散在2-丙醇的超声处理中30分钟，几滴悬浮液沉淀下来。TEM网格覆盖了一种形式的膜干燥于分析之前静置。对于根TEM，根是固定的。在2.5% GA和2% PA在0.1 M PB缓冲，ph7.4，后固定。1%锇酸盐，脱水，浸润乙醇，在以太中嵌入，在60c聚合。2天。超薄切片用2%的铀酰染色，乙酸酯和柠檬酸铅。准备被观察到使用日立H-800 TEM。加速电压是75千伏。

2.8 统计分析

所有处理都是三个重复。危害植物的毒性所有测量的端点都与那些值进行了比较未曝光的对照。统计分析了使用学生的t检验值P 6 0.01被认为是重要的数据平均值plusmn;SD(标准偏差)。

3．结果与讨论

之前的研究发现了支持碳基的证据纳米颗粒对陆生植物有不良影响。这开辟了进一步调查的道路。因此我们评估了石墨烯对生长的潜在影响。番茄、卷心菜、红菠菜和生菜都是根据测试结果提出的。并由美国环境保护署的指南编码，其中包括对种子萌发和幼苗的研究生长(根和芽生长，叶数)，常伴通过对细胞死亡的其他评价，ROS的产生，以及利用扫描电镜进行形态学研究，对取证有用。有可能的毒性的原位症状完目前正在研究石墨烯的潜在影响。说明可能对植物产生不利影响，需要对石墨烯进行生态负责的处理关于石墨烯对农业的潜在影响的更多研究和环境系统。

3.1 石墨烯的分析

水溶性石墨烯，俗称氧化石墨烯。以钠离子为反离子(溶液pH 6.32)，是在这项研究中应用AFM对形态学进行评价石墨烯;图1为典型的AFM图像。

发现所有石墨烯的明显高度在1纳米左右，表明石墨烯完全脱落。以长度为单位的单张。宽度从0.5·0.6到1.5·6.5 lm, 30片石墨烯。图2a显示了石墨烯的典型SEM图像，石墨烯薄片的形貌。图2b为TEM石墨烯的图像，它表现出典型的褶皱构造以波纹和滚动为基础。

3.2 石墨烯抑制植物生长。

我们对石墨烯的潜在效应进行了一系列的测试。番茄、卷心菜、红菠菜和莴苣的生长。

经过处理和未经处理的种子发芽后。碳49(2011)3907 - 3919 3909。在黑暗的25摄氏度培养4天。完全发芽成熟子叶和根系的幼苗如图3所示。

随着石墨烯的浓度增加，子叶和根系发育迟缓。在4天后子叶和根系，只有生菜没有受石墨烯显著影响另一方面，石墨烯具有明显的负面影响。经过20天的根和芽长和番茄的生物量，卷心菜和红色菠菜暴露在石墨烯中。观察到的影响取决于石墨烯和石墨烯的浓度持续时间的实验。在水培法实验中,当植物受到不同浓度的处理时石墨烯(0,500,1000，和2000 mg/L)， 20天的植物。以植物生长和叶片抑制为特征。随着石墨烯的增加，叶片的数量和叶片的尺寸减小。与对照组比较(图4)并显示毒性症状。

如图3和图4所示。根更短，根毛几乎消失。对于2000毫克/升的植物，石墨烯的总数量在表面聚合。根与石墨烯不成比例浓度。对芸苔属植物也有类似的结果。与其他类型的植物一起碳纳米颗粒处理的芥菜型油菜和菉豆植物。根尖和根毛产生大量的粘液，是一种高度水化的多糖。涂层在根表面，这是关键负责吸收纳米粒子的物种。在根表面，石墨烯对参数没有显著影响。在我们的试验中发现了种子发芽和生长。用莴苣做实验，对纳米粒子有自己的区别。在木质部结构中，木质部是关键的生理因素。对这个事实负责的原因。在目前的研究中,卷心菜、西红柿和红菠菜都有一个主要的根还有几个较小的侧根，而生菜有很多小根。结果是，没有显著影响。观察了石墨烯对生菜的植物毒性。与卷心菜、西红柿和红菠菜相比。卡纳斯和同事在他们的研究中描述了这个物种。

对纳米材料和反应会有不同的反应吗?事实上，物种之间也有差异。Lee等也报道。纳米粒子的毒性可能是由于。图1 -石墨烯的AFM图像3910碳49(2011)3907 – 3919显示了根解剖的差异，因为木质部结构决定水运的速度和不同的木质部结构可能表现出不同的吸收动力学。下面的讨论集中在番茄、卷心菜和红菠菜的结果。

石墨烯的存在导致了根的生长减少(图5a和b)。但是，石墨烯的浓度较低。(500毫克/升)只导致根轻微的减少长度。与此同时，对其抑制作用进行了观察。最高浓度的石墨烯(2000毫克/升)的情况下卷心菜的根和芽有明显的增加。相比之下，生长抑制率分别大于78%和61%来对照。2000 mg/L浓度石墨烯产生在根系和生长抑制中番茄的生长抑制率为分别为46%和53%。抑制长度红菠菜(13%)、500毫克/升和最高浓度(2000毫克/升)进一步表明。不能抑制芽生长(39%)。然而,没有明显的石墨烯对红菠菜根系生长的影响。红菠菜根系生长时，观察到500 mg/L。在较高的石墨烯浓度下抑制了18%(1000和2000 毫克/升)。

石墨烯的存在导致了根的减少。笋的重量(图5c和d)。卷心菜秧生长水培培养，根和芽的重量是敏感的。石墨烯和干重量分别下降了88%和81%，与最高浓度

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